在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式实验前必须准确滴定其工作浓度。
酶标记抗体的滴定方法是：将抗原（或抗体）物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体（或Ig抗体）与吸附在载体上的抗原（或抗体）起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。
其步骤为：先将抗原（或抗体）用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1%BSA-PBS液依次稀释成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……（根据抗体的滴度而定），分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分钟。以2M H2SO4 0.05ml终止反应。
结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。
最后要说明的是，本法为ELISA直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几个滴度。这就要求在建立ELISA实验系统的过程中，以此基础上还应进一步确定实际工作浓度（可采用方阵法），以达到最适的实验条件。
以上就是酶标记浓度的相关知识，希望对大家的科研工作有所帮助。
|
